Toxizität und Mutagenität dentaler Werkstoffe
Zahnärztliche Werkstoffe haben zum Teil über lange Zeit mit dem menschlichen Körper Kontakt. Dabei kommt es zu einer Wechselwirkung zwischen den Werkstoffen und oralen Geweben mit der Gefahr einer Gewebeschädigung. Zytotoxizität und Mutagenität zahnärztlicher Materialien werden deshalb mit verschiedenen Zellkulturverfahren und unterschiedlichen Zellarten charakterisiert. Zudem wird geprüft, ob beide biologischen Effekte über eine vermehrte Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zumindest teilweise ausgelöst werden.
Dentin-Barriere-Test
Die lokale biologische Wirksamkeit zahnärztlicher Werkstoffe wird von den Eigenschaften des Zielgewebes und der chemischen Charakteristik der Werkstoffe bestimmt. Entscheidend ist allerdings auch die Applikationsweise des Materials und damit die Möglichkeit der Interaktion zwischen Gewebe und Werkstoff. Komponenten aus Füllungswerkstoffen können auf die Zielgewebe der Pulpa erst nach Diffusion durch Dentin über die Dentinkanälchen einwirken. Dentin fungiert also in vivo als Diffusions- und Absorptionsbarriere zwischen Füllungsmaterial und dem Zielgewebe toxischer Komponenten.
Als Alternative zu Tierversuchen wurde eine künstliche Pulpakammer entwickelt, die die Verhältnisse in vivo weitgehend simuliert und deren Verwendung zumindest die Zahl der Tierversuche einschränken kann. Dieser Dentin-Barriere-Test in vitro enthält Dentin als modifizierende Komponente der Zytotoxizität von Füllungsmaterialien. Die Verwendung dreidimensionaler Kulturen von Zellen der Zahnpulpa ist neben dem Dentin ein weiterer wichtiger Parameter für die Simulation der in vivo Situation unter experimentellen Bedingungen. Dieses Verfahren ist Bestandteil einer ISO-Norm (ISO7405) zur Prüfung der Gewebeverträglichkeit zahnärztlicher Werkstoffe.
Mechanismen der Wirkung toxischer Komponenten zahnärztlicher Komposite
Neben der Analyse zytotoxischer Eigenschaften komplexer Werkstoffe wie etwa zahnärztlicher Komposite und vor allem ihrer einzelner Komponenten (Methacrylate, Epoxide) ist die Aufklärung der Mechanismen der Toxizität dieser Substanzen ein aktueller Forschungsschwerpunkt. Dazu gehört die Charakterisierung der differentiellen Induktion von Apoptose und Nekrose in verschiedenen Zelllinien. Das primäre Ziel unserer Forschungsaktivitäten ist es zu erklären, wie diese beiden gegensätzlichen Formen des Zelltodes durch die Aktivität von Monomeren induziert werden können. Die aktuellen Arbeiten sollen die Bedeutung verschiedener molekularer Signaltransduktionswege für die Toxizität von Monomeren aufklären. So wurde nachgewiesen, dass für das Überleben primärer humaner Pulpazellen der Phosphatidyl-Inositol 3-Kinase-Weg (PI-3 K) nach Exposition gegen Triethylenglycoldimethacrylat (TEGDMA) von zentraler Bedeutung ist. Die Bedeutung der Signalübertragung durch MAP-Kinasen wird derzeit untersucht. Außerdem scheint für die Induktion von Apoptose durch TEGDMA und 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) wichtig zu sein. Wahrscheinlich aktivieren ROS auch den Transkriptionsfaktor NfkB, der dann antiapoptotische Prozesse initiiert.
DNA-reaktive Monomere (Methacrylate) zahnärztlicher Komposite verändern die Regulation des Zellzyklus eukaryontischer Zellen. So verzögern TEGDMA und HEMA den Zellzyklus abhängig von der verwendeten Zelllinie und ihrer Konzentration sowohl in der G1- als auch in der G2/M-Phase. Wahrscheinlich wird auch diese Wirkung wenigstens teilweise durch ROS vermittelt, weil die antioxidative Substanz N-Acetylcystein (NAC) die Zellen vor DNA-Schäden schützen kann. Die Regulation der Aktivität von Proteinen, die vermutlich als Sensoren und Verstärker bei der Erkennung eines genetischen Schadens wirken, wird derzeit analysiert. Die Analysen zur Steuerung der Expression relevanter Proteine auf der Transkriptionsebene mittels DNA-Mikroarrays verweisen auf eine modifizierte Expression von Genen, die für die Regulation des Zellzyklus, der Erkennung von DNA-Schäden und der Zellproliferation von Bedeutung sind.
Etablierung permanenter Zelllinien und dreidimensionaler Zellkulturen
Für die Analyse biologischer Effekte zahnärztlicher Werkstoffe sind primäre Zellen aus potentiellen Zielgeweben, etwa der Zahnpulpa, besonders wünschenswert. Außerdem besitzen diese Primärkulturen in gewissem Umfang die Fähigkeit zur Differenzierung in vitro. Allerdings sind Zellen dieser Primärkulturen nur zeitlich begrenzt kultivierbar, und die Expression spezifischer Stoffwechselleistungen kann mit steigender Passagenzahl reduziert sein. Experimente, die konstante Eigenschaften der Kulturen erfordern, sind wegen der gewöhnlich geringen Zellzahl niedriger Passagen von Primärkulturen nur begrenzt durchführbar. Eine Alternative zur begrenzten Möglichkeit der Verwendung von Primärkulturen sind Pulpazelllinien, die durch Transfektion der Zellen mit Onkogenen aus Primärzellen erzeugt werden können. In unserem gentechnischen Labor wurden primäre Pulpazellen aus Zahnkeimen des Menschen und des Rindes immortalisiert und charakterisiert. Außerdem wurden die Eigenschaften der Primärkulturen mit den Merkmalen der daraus etablierten permanenten Zelllinien verglichen. Diese Zelllinien proliferieren auf geeigneten Trägermaterialien als dreidimensionale Zellkulturen. In einem von uns entwickelten Testsystem mit Dentin (Dentin-Barriere-Test) tragen die 3D-Kulturen dazu bei, die Lücke zwischen den Ergebnissen aus in vivo- und in vitro-Analysen zur Toxizität zahnärztlicher Füllungswerkstoffe zu schließen.
Zelladhäsion auf selbstorganisierten Monoschichten (SAMs) als Modelloberflächen
Biomaterialien aus Metall, Polymeren und Keramiken dienen dazu, die Struktur und Funktion traumatisch, tumorös oder infektiös geschädigter Gewebe zu unterstützen oder vollständig zu ersetzen. Diese Werkstoffe unterstützen etwa die Funktion von Knochen und Gelenken in Form von Stiften oder künstlichen Hüft- und Kniegelenken. Dabei bedingen die Morphologie und die Struktur und die damit verbundenen unterschiedlichen Anforderungen der verschiedenen Gewebe die Verwendbarkeit von Werkstoffen. Die Art der Interaktion von Zellen und Material bestimmt die Gewebeintegration und damit die Verträglichkeit eines Biomaterials (Biokompatibilität). Die Oberfläche eines Materials ist der wesentliche Faktor für dessen Biofunktionalität, denn sie entscheidet über die initiale Adhäsion von Proteinen, Bakterien und eukaryontischen Zellen. Die Art der initialen Adhäsion eukaryontischer Zellen, etwa Osteoblasten oder Fibroblasten, auf einer Materialoberfläche bestimmt den Ablauf und die Steuerung der darauf folgenden Prozesse des Überlebens adherierender Zellen, der Zellspreitung, Zellmorphologie, Zellproliferation und Zellmigration sowie der Zelldifferenzierung. Ein anderer wichtiger Aspekt der Gestaltung von Oberflächen ist außerdem, in wie weit sie die Adhäsion von Bakterien fördern. Die Kolonisation durch pathogene Keime entscheidet häufig über den klinischen Erfolg eines Implantats.
S ynthetische Oberflächen auch klinisch verwendeter Biomaterialien, etwa diejenige von Polymeren, unterscheiden sich sehr stark in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften. Sie haben verschiedene Oberflächenladung und Oberflächenenergie (Hydrophobizität). Siliziumwafer dienen uns als Modelloberfläche für die Analyse der Adhäsion von Bakterien und eukaryontischen Zellen. Eine biologische Funktionalisierung dieser Oberflächen erfolgte zunächst über die chemische Modifizierung durch selbstorganisierte Monoschichten (SAMs). Stark hydrophobe Oberflächen entstehen etwa durch eine Silanisierung mit hydrophoben Endgruppen, andere funktionelle Gruppen (OH, COOH, NH3, PEG) hingegen erzeugen hydrophile polare oder geladene Oberflächen.
Unsere zellbiologischen und morphologischen Analysen zeigten, dass die Adhäsion von Osteoblasten und Fibroblasten weniger vom Grad der Benetzbarkeit einer Oberfläche beeinflusst wird, sondern mehr von den verfügbaren funktionellen chemischen Gruppen abhängt. So etwa wurden die Adhäsion und Proliferation eukaryontischer Zellen auf fluorierten (CF3) Oberflächen deutlich inhibiert. Momentan scheint eine auf unsere Weise mit Polyethylenglykol beschichtete glatte Oberfläche ein viel versprechendes Modell für die Entwicklung klinisch relevanter Implantate in Hartgeweben zu sein. Diese Oberfläche fördert die Adhäsion von Osteoblasten und Fibroblasten und inhibiert die Adhäsion pathogener Staphylokokken.
Proteinadsorption und Bakterienadhäsion an Biomaterialoberflächen
Bakterielle Infektionen sind eine häufige Ursache für einen Misserfolg bei der Implantation von Biomaterialien. Auch bei einer Vielzahl von zahnärztlichen Materialien kann bakterielle Kolonisierung zu Fehlschlägen führen. Aus diesem Grund ist es wichtig, chemische und physikalische Modifizierungen von Biomaterialoberflächen zu entwickeln, welche Bakterienadhärenz verhindern ohne gleichzeitig die Gewebeintegration zu stören. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die Adhäsion von Bakterien auf Implantatoberflächen durch die Adsorption von Proteinen aus relevanten Körperflüssigkeiten modifiziert wird. In diesem Arbeitsprojekt wurden daher neue grundlegende Methoden zur in situ-Bestimmung der Proteinadsorption aus den Körperflüssigkeiten Serum und Speichel sowie zur Quantifizierung der adhärenten Bakterien entwickelt. Mit diesen Methoden wurde in einem Modellsystem basierend auf chemisch modifizierten Siliziumwafern der Einfluss chemischer Modifizierungen und der Oberflächenrauhigkeit untersucht. Dieses Modellsystem sollte geeignet sein, die Wirkung neuartiger bakterienabweisender Beschichtungen experimentell zu testen. Die neuentwickelten Nachweismethoden eignen sich darüberhinaus für die zukünftige Untersuchung von klinisch relevanten Biomaterialien in Medizin und Zahnmedizin hinsichtlich Proteinadsorption und Bakterienadhäsion.
Letzte Aktualisierung: 08.10.2009 | Online-Redaktion
